odsek za biokemijo in molekularno biologijo rekombinantni proteini dobljeni s pomocjo mikroorganizmov so v raziskovalnih laboratorijih nenadomestljivi po tem ko so sredi sedemdesetih let v laboratorijih prvic uspeli prenesti gen ki je nosil zapis za tocno doloceno beljakovino iz enega mikroorganizma v drugega se je v biokemijskih laboratorijih po vsem svetu zacelo novo obdobje raziskav ta dosezek je dokazoval da so znanstveniki tedaj v osnovi razumeli reakcije potrebne za obstoj in razmnozevanje organizmov torej tiste procese ki potekajo v zivih celicah vsak trenutek delitev dna prepisovanje v rna in prevajanje v proteine hkrati pa so poznali tudi encime ki sodelujejo pri izrezovanju ko ckov dna njihovem ponovnem spajanju in pri podvojevanju in prepisovanju vse to znanje ki se je v osemdestih letih e bistveno izpopolnilo je temelj tako imenovanemu genskemu inzeniringu ki nam danes omogoca da proizvedemo posamezno clovesko beljakovino v bakterijah kvasovkah ali pa v gojenih insektnih ali sesalskih celicah razen tega danes znanstveniki lahko transformirajo zivali ali rastline tako da na osnovi na novo vnesenih genov proizvajajo njim nelastne beljakovine tega pa raziskovalci ne pocnemo iz kaksne objestnosti temvec zato ker lahko s pomocjo rekombinantnih beljakovin ali s studijem transgenih organizmov to so organizmi v katere smo vnesli tuj gen na tak nacin da ga bodo lahko podedovali tudi njihovi potomci razjasnimo masikateri doslej nerazumljen nacin delovanja posameznih beljakovin predvsem pa njihove interakcije z drugimi molekulami in nacine regulacije znotraj posameznih celic pa tudi organizmov v prvi polovici osemdesetih let je v svetu vecina naprednih laboratorijev ki so se ukvarjali s proteinsko biokemijo zacela z raziskavami na podrocja genskega in proteinskega inzeniringa odsek za biokemijo instituta jozef stefan je v letu zacel s prvimi raziskavami na tem podrocju sprva v sodelovanju z institutom za biokemijo medicinske fakultete kmalu pa ze samostojno in s pomocjo znanja ki so ga nasi sodelavci prinesli iz nemcije in zdruzenih drzav amerike ze v letu smo objavili prvi clanek s tega podrocja v njem smo porocali o pripravi rekombinantnega stefina b sorazmerno majhne beljakovine ki smo jo nekaj let prej odkrili na nasem odseku in nosi ime po institutu in ki ima lastnost da zavira delovanje nekaterih encimov sestaviti nam je uspelo sintetski gen z zapisom za cloveski stefin b in na osnovi gena pripraviti to beljakovino v bakterijskih celicah znanje in obseg dela sta se v zacetku devetdesetih let toliko povecala da se je odsek preimenoval v odsek za biokemijo in molekularno biologijo od prvotnih izolacij in dolocanja kemijskih lastnosti beljakovin pa je odsek bolj in bolj prehajal na raziskave celicnih procesov in vloge posameznih encimov pri tem najsodobnejse aparature za dolocanje aminokislinskega zaporedja beljakovin cirkularnega dikrografa in rentgenskega refraktometra omogocajo vpogled v strukturo beljakovin od zaporedja aminokislin preko nacina kako se te aminokisline med seboj nizajo v urejene strukture do trodimenzionalne predstavitve velikih molekul in nacrtovanja molekul ki se vezejo na beljakovine skupina biokemikov na institutu jozef stefan se danes lahko kosa z najboljsimi laboratoriji za raziskovanje strukture in funkcije proteinov v evropi v vecini zivih celic tudi cloveskih beljakovine neprestano nastajajo in se neprestano razgrajujejo raziskovalce na nasem odseku zanimajo predvsem poti razgradnje celicnih beljakovin razumeli bi radi kompleksno naravo same cepitve velikih proteinskih molekul do kratkih fragmentov in aminokislin ki jih lahko celica porabi za ponovno sintezo novih beljakovin hkrati pa nacine regulacije tovrstne razgradnje saj je zelo pomembno da celica razgradi le beljakovine ki ji niso potrebne razen tega nas zanima delovanje proteaz encimov ki razgrajujejo beljakovine pri mnogih boleznih od katerih je nasa pozornost najpogosteje usmerjena na rakasta obolenja saj je vloga teh encimov pri siritvi in metastaziranju tumorjev ze dokazana za encime je znacilno da so zelo aktivne molekule saj lahko ena molekula encima cepi na tisoce molekul beljakovine ki jo razgrajuje ker so encimi tako aktivni jih celica za brezhibno delovanje potrebuje zelo malo to pa seveda otezkoca njihov studij osnovno razumevanje delovanja encimov je mogoce samo ce jih studiramo v cisti obliki zato moramo encime iz celic najprej izolirati in pogosto jih je v celicah tako malo da jih v zapletenih in dolgotrajnih postopkih vlecejo se lahko vec tednov ali celo mesecev uspemo iz enega kilograma tkiva izolirati komaj nekaj mikrogramov za studij encimov se posebej cloveskih ki jih je tezko pridobiti iz naravnih tkiv je genski inzeniring ponudil pravo resitev saj lahko te redke beljakovine pridobimo v enakem casu v tisockrat vecjih mnozinah iz celic izoliramo gen ki nosi informacijo za sintezo encima ta gen preko tocno definiranih vektorjev vstavimo v bakterjske celice in bakterije bodo zacele proizvajati rekombinantni encim na osnovi gena ki smo ga npr izolirali iz cloveskih celic bakterije lahko v laboratoriju v nekaj dneh proizvedejo vec sto miligramov rekombinantne beljakovine postopki ciscenja pa so pogosto enostavnejsi kot so tisti ki so jih raziskovalci razvili za ciscenje encimov iz zivalskih ali rastlinskih tkiv osnovne raziskave na nasem podrocju lahko privedejo tudi do nekaterih prakticnih zakljuckov ceprav je vecina raziskovalnega dela na odseku usmerjenega na znotrajcelicne proteaze smo se v enem od raziskovalnih projektov lotili studija kimozina to je encima ki povzroca sesirjenje mleka in ga uporabljajo pri proizvodnji sirov mlekarji uporabljajo za svoje delo razlicne preparate dolgo so mleko sirili tako da so mu dodali izvlecek iz telecjih zelodcev tak ekstrakt je bil zelo heterogen in je razen nujno potrebnega kimozina vseboval se mnoge druge sestavine ko smo raziskovali kimozin pri govedu in drobnici smo ugotovili da se goveji in ovcji encim med seboj nekoliko razlikujeta ceprav je res da lahko z govejim encimom sesirimo ovcje mleko in obratno na odseku smo ob raziskavah delovanja obeh encimov razvili tudi postopek po katerem lahko proizvedemo cist rekombinantni ovcji kimozin s pomocjo zdravju neskodljivih laboratorijskih sevov bakterije escherichia coli postopek smo patentirali in v poskusni proizvodnji v sodelovanju z biotehnisko fakulteto tudi dokazali da je z rekombinantnim ovcjim kimozinom mogoce pripraviti zelo kvaliteten in okusen sir vecina dela v gensko tehnoloskih laboratorijih pa je se vedno usmerjenega v temeljne raziskave da bi razumeli delovanje encimov nam je v veliko pomoc ce lahko raziscemo prostorsko strukturo teh molekul beljakovine so v vecini primerov kroglaste molekule s premerom nekaj nm ki imajo povrsino nagubano in posejano z rezami in izrastki kot trodimenzionalne molekule jih lahko prikazemo po tem ko smo iz uklonskih zarkov rentgenske svetlobe ki seva skozi kristal beljakovine izracunali razdalje med posameznimi atomi ki sestavljajo molekulo govorimo o rentgenskih strukturah beljakovin gre pa za trodimenzionalno strukturo ki kaze katere aminokisline so na povrsini in katere na mestih ki so odlocilna za delovanje teh beljakovin prepoznamo lahko vezavna mesta za druge molekule razumemo lahko zakaj proteaza cepi samo nekatere vrste beljakovin drugih pa ne in zakaj nekatera protitelesa spoznajo le dolocene dele beljakovin podobne rezultate vendar za zdaj le pri manjsih proteinskih molekulah nam daje tudi analiza beljakovin z jedrsko magnetno resonanco da pa eksperimentalno poiscemo pogoje pri katerih bo protein tvoril kristal kakrsnega rabimo za dolocanje rentgenske strukture potrebujemo v povprecju vsaj mg beljakovine pred uporabo tehnik rekombinantne dna bi bilo prakticno nemogoce dobiti dovolj nekaterih proteaz v cisti obliki da bi sploh lahko pomislili na kristalizacijo zdaj temu ni vec tako v nasi raziskovalni skupini nam je v preteklem letu uspelo v bakteriji escherichia coli pripraviti rekombinantni prokatepsin b to je neaktivno obliko enega od znotrajcelicnih proteoliznih encimov ki v celicah po odcepu priblizno ene tretjine molekule preide v aktiven encim ta je sposoben cepiti mnoge celicne beljakovine in dokazali so da je pomemben pri procesu metastaziranja tumorjev rekombinantni prokatepsin b smo kristalizirali in na osnovi kristala dolocili njegovo prostorsko strukturo to je bil prvi cloveski proencim iz skupine cisteinskih proteaz v aktivnem mestu imajo aminokislino cistein katere kristalna struktura je bila objavljena na kar smo se posebej ponosni pokazalo se je da je proencim neaktiven zato ker tista tretjina molekule ki se kasneje v celici odcepi kot debela nit prekriva rezo v kateri lezijo aminokisline aktivnega centra in tako onemogoca dostop beljakovinskim substratom ugotovili smo tudi da je prakticno nemogoce da bi se proencim sam aktiviral do zrele aktivne oblike saj mesto kjer se proencim precepi lezi dalec od aktivnega mesta znanje ki smo ga pridobili pri raziskavah znotrajcelicnih proteaz smo lahko s pridom uporabili ko smo v sodelovanju s farmacevtsko tovarno krka iz novega mesta razvili komplete kemikalij ki omogocajo imunokemijsko dolocanje koncentracij posameznih proteaz ali inhibitorjev beljakovin ki zavirajo delovanje proteaz v vzorcih seruma ali celicnih ekstraktih dobljenih pri biopsiji pacientov z rakom dokazali smo da so mnoge proteaze zanesljiv prognosticni pokazatelj koncentracija teh beljakovin v vzorcih nam pove kaksne so moznosti pacienta za daljse prezivetje in s tem odlocilno pomagajo zdravnikom pri izbiri najprimernejse terapije kompleti kemikalij vsebujejo tudi kontrolni protein na podlagi katerega klinicni in raziskovalni laboratoriji umerjajo teste kontrolni proteini so rekombinantni cloveski proteini dobljeni iz bakterijskih celic v sodelovanju z zavodom za transfuzijo krvi pa smo razvili teste za dolocanje krvnih skupin s pomocjo monoklonskih protiteles teste so kasneje na zavodu izpopolnili in jih uporabljajo pri svojem rutinskem delu poseben problem predstavlja razumevanje delovanja beljakovin ki imajo vec funkcij in interagirajo z vec tarcnimi molekulami ena od takih beljakovin je fosfolipaza iz modrasovega strupa fosfolipaze so encimi ki razgrajujejo elemente celicnih membran vendar pa neodvisno od te encimske aktivnosti delujejo tudi kot toksini da bi razumeli kako je to mogoce smo pred leti pripravili vec monoklonskih protiteles ki so zakrila tocno dolocena obmocja na povrsini molekule poskusali smo ugotoviti katera protitelesa po vezavi na fosfolipazo ugasnejo encimsko aktivnost in katera toksicno delovanje vendar pa popolnega odgovora s tem pristopom nismo dobili ko nam je uspelo pripraviti rekombinantno modrasovo fosfolipazo v bakterijah kar smo naredili tako da so bakterije proizvajale nestrupene molekule ki smo jih najprej iz bakterij izolirali potem pa sele aktivirali je bila pot do resitve problema odprta gen za fosfolipazo lahko modificiramo tako da na tocno dolocenih mestih zamenjamo eno ali vec baz s temi mutacijami pa spremenimo zaporedje aminokislin v rekombinantni beljakovini ce spremenimo tiste aminokisline za katere predvidevamo da so v aktivnem mestu encima oziroma tiste ki so v toksicnem centru lahko na podlagi encimske in toksicne aktivnosti mutirane fosfolipaze ugotovimo ali so nase predpostavke pravilne trenutno se ukvarjamo s testiranjem vec mutant pri katerih studiramo tako encimsko aktivnost kot njihovo toksicnost pa tudi vezavo na receptorje velike molekule na celicni povrsini ki so bistvene za toksicno delovanje fosfolipaz genska tehnologija omogoca tudi dolocanje zaporedja sekvence baz v genih geni nosijo zapis ne le za beljakovine pac pa tudi informacijo o tem kako pogosto v katerih celicah in v kateri razvojni fazi se bo gen prepisoval dolocanje zaporedja baz nam tako lahko odgovori na vprasanja ki jih proteinska biokemija ne bi mogla razresiti razen tega lahko primerjava sekvenc med razlicnimi organizmi pojasni nekatera zanimiva opazanja v zvezi z evolucijo tako smo na primer ugotovili da je nek tocno dolocen vkljucek v kromosomski dna retropozon art nenavadno podoben pri plazilcih in govedu ob klasicnem poteku evolucije bi bilo to prakticno nemogoce podobni primeri znotraj posameznih vrst so sicer znani to pot pa gre za poseben nacin prenosa genov med filogenetsko oddaljenima razredoma ki doslej ni bil znan ko smo preucevali odziv strocnic na suso in krompirja na poskodbe in virusne bolezni smo opazili da pogosto pride do povecanja koncentracije nekaterih proteaz in inhibitorjev ob tem smo osvojili tudi tehnike s katerimi lahko vnesemo tuje gene v rastlinske celice pred kratkim nam je uspelo v laboratoriju pripraviti transgeni krompir ki nosi gen za clovesko proteazo ko nam bo uspelo dokazati da se gen za proteazo v rastlini tudi izraza kot beljakovina bo to omogocalo da na cenen nacin pridobimo velike kolicine cloveskega encima iz rastlinskih celic brez kloniranja genov s pomocjo mikroogranizmov torej veliko aktualnih vprasanj v biokemiji in molekularni biologiji ne bi bilo mogoce resiti saj je to edini nacin kako pridobiti zadostne kolicine izredno redkih beljakovin po drugi strani genski inzeniring omogoca spreminjanje tocno dolocenih aminokislin v beljakovini pridobljene mutante nam sluzijo kot modeli ki edini lahko odgovorijo na vprasanje kateri deli beljakovinskih molekul so odgovorni za posamezne lastnosti teh molekul sele ko razumemo kako so encimi zgrajeni in kako delujejo pa lahko nacrtujemo snovi ki so sposobne delovanje encimov zavreti pri mnogih boleznih med katere sodi na primer osteoporoza pride do razvoja bolezni zaradi prekomernega delovanja nekaterih proteaz molekule ki bi ustavile to skodljivo delovanje bi lahko uporabili kot zdravilo gensko tehnologijo na siroko uporabljajo v vseh sodobnih laboratorijih s podrocja proteinske biokemije in celicne biologije pa tudi v nekaterih aplikativnih panogah in med njimi je tudi vse vec slovenskih raziskovalnih skupin odsek za biokemijo in molekularno biologijo instituta jozef stefan ima na tem podrocju veliko znanja in izkusenj o uspehih s tega podrocja pa pricajo clanki objavljeni v najuglednejsih mednarodnih revijah