molekularna biologija prionov marko dolinar institut jozef stefan odsek za biokemijo in molekularno biologijo dopolnjen povzetek predavanja na mikrobioloskih vecerih ta povzetek je narejen na osnovi referata molekularna biologija prionskih bolezni v diskusijski skupini za molekularno biologijo marca novosti v letu so opisane na koncu povzetka najnovejsa spoznanja po novembru ' so vnesena v povzetek z modro zeleno barvo prenosljive encefalopatije so nevrodegenerativna obolenja pri zivalih in ljudeh povzrocitelj je prion strukturno spremenjena molekula normalnega celicnega proteina prpc in predstavlja najmanjsi znan patogen spekter bolezni ki jih povzroca zajema pri cloveku kuru bolezen novogvinejskih kanibalov ter dedne creutzfeldt jakobovo bolezen cjd gerstmann sträußler scheinkerjev sindrom gss usodno dedno nespecnost ffi in alperjevo bolezen pri zivalih pa med drugim skrapiozo ovce in koze in spongiformno encefalopatijo pri govedih bse znano pod imenom 'bolezen norih krav' odkrili so jo pri govedih holsteinsko frizijske pasme in ugotovili da prioni iz goveda lahko okuzijo prasice koze ovce in misi ne pa tudi hrckov zdravila za te bolezni ni normalni celicni prpc na doslej se ne povsem raziskan nacin posttranslacijsko preide v patogeno obliko prpsc ta prehod spremlja sprememba v strukturi prp ir spektroskopija in analize s cirkularnim dikroizmom so pokazale da prpc vsebuje alfa helikalne strukture in skoraj nic beta strukture medtem ko vsebuje prpsc oblika beta in helikalne strukture kristalizacija nobene od oblik prp se ni dala rezultatov zato so modeli terciarne strukture zgolj hipoteticni s predikcijskimi algoritmi so ugotovili mozne strukturne sklope in trije od stirih sinteticnih peptidov narejenih na osnovi teh studij so se v raztopini zvili v beta obliko ter se agregirali v palicke z amiloidnimi lastnostmi struktura prp pomemben prispevek k razumevanju narave bolezni je bila izolacija prionskega proteina najprej iz okuzenih hrckovih mozgan zatem pa tudi odkritje cdna ki zapisuje za ta protein protein je kodiran na kromosomalni dna in nivo mrna za ta protein je enak pri zdravih in obolelih osebkih normalni prionski protein prpc je glikoprotein velikosti kda in je obcutljiv na delovanje proteinaz medtem ko so iz obolelih mozgan izolirali obliko ki je rezistentna na proteinaze in ima maso kda pri hrcku in misih je primarni translacijski produkt protein z aa in zapis zanj je enak pri bolnih in zdravih zivalih cloveski prp sestavlja aa in vkljucuje aa dolgo signalno sekvenco ki se odcepi ob prehodu v er preko ga protein preide na celicno povrsino kamor se zasidra z glikoinozitolnim fosfolipidom gpi s c ternimalnega dela molekule pa se odcepi se aa na podrocju zanke ki nastane za disulfidno vezjo sta vezana oligosaharida pripeta na asp v ga se na oba oligosaharida veze se sialinska kislina kot je znacilno za vse proteine sidrane preko gpi tudi prpc ponovno vstopi v celico preko membranskih veziklov ob strukturni spremembi prpc v prpsc so opazili da se z omejeno proteolizo ob delovanju proteinaze k z n terminalnega dela prpsc odcepi se okrog aa preostanek pa je za proteaze rezistenten in ga oznacujejo kot prp model replikacije prionov konformacijski model replikacije prionov je takle prpc bi se stohasticno pretvoril v delno razvit monomer prp ki je intermediat v tvorbi prpsc prp lahko preide nazaj v prpc lahko se razgradi lahko pa tvori prpsc pod normalnimi pogoji bi bilo prp malo in prpsc bi nastajal v nesignifikantnih mnozinah pri infektivnih prionskih boleznih bi eksogeni prioni ki vsebujejo prpsc delovali kot matrice za pretvorbo prp v prpsc ker je prpsc netopen bi bila reakcija ireverzibilna ker bi se koncentracija prp zaradi pretvorbe v prpsc zmanjsala bi to povzrocilo povecanje nastajanja iz prpc in na ta nacin bi ponovno lahko prislo do tvorbe prpsc pri podedovanih prionskih boleznih bi mutacija v prpc destabilizirala strukturo proteina in povecala nastajanje prp s tem pa bi se povecala verjetnost nastajanja prpsc narava mutacij ki so jih doslej identificirali pri dednih prionskih boleznih to hipotezo podpira saj so mutacije na obmocju kjer so napovedali helikalno strukturo ali pa na delu molekule ki naj bi vzdrzevala stabilnost celokupne strukture sporadicne prionske bolezni hipoteza razlaga s slucajnim nakopicenjem prp pri transgenih misih ki prekomerno eksprimirajo normalni gen za prp pride do nastanka prionov in razvoja spongiformne degeneracije prav tako je mogoce da pride pri spontanih oblikah bolezni do mutacij ki imajo enak ucinek kot mutacije pri dednih oblikah bolezni da gre pri nastanku prpsc res za konformacijsko spremembo dokazuje eksperiment j tatzelt et al embo j v katerem so z dodatkom glicerola dmso ali tmao avtorji jih imenujejo 'kemicni caperoni' v inficiranih misjih nevroblastomskih celicah povzrocili upocasnitev prehoda prpc v prpsc kar razlagajo z efektom stabilizacije alfa helikalne strukture v prpc na ze formirane prpsc kemijski caperoni niso imeli efekta medvrstna bariera ze dolgo je znano da lahko prioni izolirani iz obolelih organizmov povzrocijo razvoj bolezni pri pripadnikih druge vrste s poskusi na transgenih misih so ugotovili da je infekcija najbolj ucinkovita ce sta n terminalni aminokislinski zaporedji prpsc iz ene vrste in prpc druge vrste identicni v nasprotenem primeru se bolezen sicer razvije a z daljso inkubacijsko dobo pri tem govorijo o medvrstni barieri vendar je zanimivo da so naslednje pasaze infektivnega agensa vedno bolj efektne in se inkubacijska doba krajsa kar kaze na to da se morda aminokislinska zaporedja prpc in prpsc izenacijo pri knockout misih brez prp prn p so opazili da se po inokulaciji s prioni misje skrapioze bolezen ne pojavi niti po letih medtem ko so testne w t misi poginile v mesecih genska struktura in ekspresija genetsko gledano so prionske bolezni dveh tipov ene so dedne druge pa spontane frekvenca sporadicne cjd je vendar so patolosko dedne in spontane oblike bolezni enake tistim ki jih povzrocimo z inokulacijo prpsc v zdrav organizem pri dednih oblikah bolezni so ugotovili jasno segregacijo bolezenskih znakov z mutacijami v genu prn p to pomeni da so mutacije zadosten razlog za konformacijski prehod prpc v prpsc in s tem razvoj bolezni mutacije pa same ne povzrocijo bolezni pac pa povecajo pogostost konformacijske konverzije v prpsc obliko pri cloveku je gen za prp lociran na kratkem kraku kromosoma orf za prpc je v celoti znotraj enega eksona kar pomeni da variante prp ne morejo nastati zaradi alternativnega splicinga rna celotni gen je pri hrckih na eksonih ki sta locena z kb intronom pri misi pa na eksonih mrna za prp se pri odraslih zivalih eksprimira konstitutivno najvecja koncentracija mrna je v mozganskih nevronih dedne prionske bolezni pri cloveku okrog primerov cjd je dednih mutacija na kodonu prp je genetsko povezana z gss ko so uvedli mutacijo na ustreznem mestu pri transgenih misih so opazili spontane degenerativne znake v cns tipicne za misjo skrapiozo vendar pa je bila mnozina prpsc v mozganih teh misi zelo nizka pri juznoangleskih druzinah z dedno cjd so opazili insercijo bp ki kodira za ponovitev oktapeptidne sekvence normalni prp vsebuje le takih ponovitev nekateri drugi osebki s cjd so imeli po ali dodatnih ponovitev delecija enega ali insercija takih ponovitev pa ne povzroci bolezni cjd je pogosta med izraelskimi zidi ki izhajajo iz libije sprva so menili da je razlog v tem da jedo na hitro prekuhane ovcje mozgane in oci vendar pa so pri nekaterih libijskih in tunizijskih zidih s cjd odkrili tudi mutacijo na kodonu gre za avtosomalno dominantno okvaro kakrsna je npr huntingtonova bolezen identificirali so se vrsto drugih mutacij ki koincidirajo z razvojem prionskih bolezni po eni od teorij povzroci mutacija v prp vecjo obcutljivost posameznika za napad virusa skrapioze prehod prpc v prpsc in vitro za proteaze rezistentno obliko prp je uspelo pripraviti in vitro v brezcelicnem sistemu kar utegne razjasniti mehanizem konformacijskega prehoda in spekter medvrstnih barier do tvorbe rezistentne oblike pride ko radioaktivno oznacenemu prpc dodajo neoznacen prpsc ki deluje kot jedro konformacijske spremembe v dveh dneh in vivo bi bilo pri transgenih misih potrebno vsaj dni da bi zaznali degenerativno spremembo v cns do konformacijskega prehoda verjetno pride po tem ko v prvi fazi prpsc z delno nativno strukturo interagira s prpc stabilizacija beta strukture prpc tvorba h vezi med molekulama med pretvorbo ni potrebna sinteza nove prpc niti sprememba v glikozilaciji niti ni potrebna prisotnost glikofosfatidil inozitolne stranske verige gre torej za direktno interakcijo med dvema oblikama proteinskih molekul kvasni prioni protein z lastnostmi priona so odkrili tudi pri kvasovkah protein ure p ki je udelezen v metabolizmu dusikovih substanc pri kvasovkah in je bil sam znan ze pred vec kot leti lahko v redkih primerih spontano s frekvenco preide v neaktivno obliko ure p ki nato povzroci inaktivacijo vseh preostalih funkcionalnih molekul ure p tak fenotip oznacujejo kot ure in 'mutacijo' ki ga je povzrocila ure p je kodiran na kromosomskem genu inaktivacijske ali delecijske mutacije povzrocijo enak fenotip kot selekcija mutant je lahka saj mutante lahko porabljajo ureidosukcinat v prisotnosti nh in s tem lahko kljub temu da ne morejo sintetizirati prekurzorja uracila rastejo v odsotnosti uracila podobno je z determinanto ki so jo opisali kot modifikatorja nonsense supresije pod vplivom trna odgovoren je produkt gena sup dolg aa in na n terminalnem delu vsebuje ponovitve aa kar je podobno kot pri prp pri ure p takih ponovitev sicer ni vendar je mehanizem delovanja podoben literatura prusiner s b molecular biology of prion diseases science carlson g a et al genetics of prion infections trends in genet bayreuther k masters c l catching the culprit prion nature cohen f e et al structural clues to prion replication science weissmann c the prion connection now in yeast ibid tuite m f psi no more for yeast prions nature wickner r b is an altered ure protein evidence for a prion analog in saccharomyces cerevisiae science kocisko d a et al cell free formation of protease resistant prion protein nature bessen r a et al non genetic propagation of strain specific properties of scrapie prion protein nature kocisko d a et al species specificity in the cell freee conversion of prion protein to protease resistant forms a model for the scrapie species barrier proc natl acad sci usa novosti v opisali so novo obliko cjd ki jo oznacujejo kot nvcjd new variant cjd zanjo je znacilno da je povprecna starost obolelih bistveno nizja kot pri obicajni cjd da med zgodnjimi simptomi nastopajo psihicne tezave bolezen pa traja dalj kot obicajno prihaja do povecane tvorbe amiloidnih plakov in da ni za cjd tipicnih sprememb v eeg sklepajo da je ta oblika bolezni pravzaprav posledica okuzbe z bse ki je presla medvrstno bariero to delno potrjujejo zadnji rezultati molekulske analize ki kazejo da pri nvcjd prp nastopa v razlicno glikoziliranih oblikah tako kot pri bse ne pa v treh kot pri normalnem cjd z metodo ki razlikuje glikozilacijske vzorce prp je mogoce diagnosticirati in delno okarakterizirati vrsto prp pri pacientih v zgodnjih stadijih bolezni s poskusi na transgenih knock out misih ki nimajo funkcionalnega gena za prp so ugotovili da pri dolocenih pogojih hranjenja misi v svoji zgodnji starosti po tednu razvijejo bolezenske znake ki so podobni tistim ki jih povzroci inokulacija misi s povzrociteljem skrapioze patoloska analiza je pokazala da je cerebelum za tretjino manjsi kot pri normalnih misih in da je stevilo purkinjejevih celic izrazito zmanjsano raziskovalci domnevajo da je normalna funkcija prp ta da v dolocenem zivljenjskem obdobju onemogoca odmiranje purkinjejevih celic spekulirajo tudi da so bolezenski znaki prionskih bolezni posledica zmanjsanja koncentracije prpc ne pa poskodb celic zaradi agregatov prpsc dolocili so trodimenzionalno strukturo druge domene misjega prp s pomocjo nmr dolocena struktura se razlikuje od modelov ki so bili doslej v veljavi kot zelo verjetni druga domena sama vsebuje beta plosci in alfa helikse pred razresitvijo strukture so predvidevali da prpc oblika sploh ne vsebuje beta strukture zato je to odkritje zelo pomembno pri razlagi iniciacije konformacijskega preklopa v prpsc obliko evropska komisija je zbrala vrhunskih strokovnjakov s podrocja prionskih bolezni in jim dala za nalogo da postavijo strategijo raziskav na tem podrocju med prednostne naloge znanosti so strokovnjaki ki jih vodi prof weissmann z eth v zuerichu vkljucili naslednje ugotoviti ali se bse lahko prenese na cloveka razvoj zdravil ki bi zaustavila napredovanje cjd ugotoviti ali navidez zdrave zivali prenasajo povzrocitelja bse ugotoviti kako in med katerimi zivalmi vrstami se bolezen lahko prenasa ugotoviti ali lahko inficirano tkivo okuzi zdravo tkivo v klavnici diagnosticanje bolezni pred nastopom prvih bolezenskih znakov najti primerne postopke za sterilizacijo okuzenega tkiva zanimiva novejsa literatura in naslovi na internetu r riek et al nmr structure of the mouse prion protein domain prp nature j collinge et al molecular analysis of prion strain variation and the aetiology of 'new variant' cjd nature k y kreeger researchers homing in on mechanisms of encelophathic diseases the scientist http yr june index html pogled na trenutne raziskave vec prostora namenja iskanju morebitnega virusa ki bi bil povezan s spongiformnimi encefalopatijami pregled tekoce literature s stalisca veterine in zdravstvene politike iz decemberskega public health news http www cabi org whatsnew bse bsephn htm ocena kako bse ne predstavlja rizika za cloveka zdravstvena statistika distribucija smrtnost http http brunel ac uk ~hssrsdn bse cjd htm s sakaguchi et al loss of cerebellar purkinje cells in aged mice homozygous for a disrupted prp gene nature stanley prusiner eden od pionirjev raziskav na podrocju prionov razlaga svoj pogled na pretekla in sodobna dognanja v zvezi s prionskimi boleznimi http www nmia com ~mdibble prion html kako caperoni verjetno sodelujejo pri prionskih encefalopatijah opisujejo n kenward et al na http www ccc nottingham ac uk ~mbzspd tutorials csc html na kratko pa tudi edenhofer et al na http www lmb uni muenchen de groups winnacker weiss jvi htm d c krakauer et al phylogenesis of prion protein nature zgodovina bse http www airtime co uk bse hist htm animacija konformacijske pretvorbe temelji se na starih modelih strukture prp http www lmb uni muenchen de groups winnacker weiss conversion h tm sinopsis predavanja dr heaphya virologom prionske bolezni povzrocitelj moznosti za okuzbo z bse spekulacija o tem koliko ljudi bo v uk zbolelo zaradi bse http www micro msb le ac uk bse sh html isti avtor je pripravil tudi sistematicen pregled znanja o prionskih boleznih http www micro msb le ac uk prions html zacetna stran http www airtime co uk bse welcome htm z mnogimi povezavami vkljucno s pregledom starejse in novejse http www airtime co uk bse scij htm literature znanstvene in prispevki v dnevnem casopisju in revijah zgodovino dogajanja v zvezi z bse http www airtime co uk bse hist htm statistiko o prionskih boleznih biologijo prionskih bolezni http www airtime co uk bse tse htm itd pismo pacienta ki je imel hemofilijo a se je preko zdravila okuzil z virusom hiv in prioni ali bolnemu cloveku se lahko vse zgodi http www nmia com ~mdibble aletter html stran s povezavami do drugih streznikov s podatki o prionih nekatere zastarele nekatere podvojene a vendar tudi nekaj uporabnih http nmrwww chem rug nl nmr people ab html prionlinks html prusiner s b molecular biology and pathogenesis of prion diseases trens in biochemical sciences tibs december ' nov pregledni clanek napisan za studente razlaga najpomembnejse fenomene v zvezi s prioni pripombe in vprasanja posljite na naslov marko dolinar ijs si ta verzija je bila pripravljena za www