diskusijska skupina za molekularno biologijo povzetki molecular biology discussion group abstracts nazaj na informacijsko stran dsmb prokariotski in eukariotski replikon enota replikacije katja drobni c celotni genom organizma se mora deliti le enkrat pred celicno delitvijo kako je replikacija povezana s celicnim ciklom obstaja dvoje dejstev iniciacija replikacije pripravi celico tako pro kot eukariotsko za nadaljno delitev ko se enkrat replikacija zacne nadaljna delitev celice ni mozna vse dokler replikacija ni koncana enoto dna ki se samostojno podvojuje imenujemo replikon ta je lahko en sam prokariotska celica ali pa jih je vec na celico eukariotska celica studije prokariotskih virusnih in kvasnega saccharomyces cerevisiae replikona so pokazale da je prva stopnja v replikaciji prepoznavanje specificnih sekvenc v ori oz ars t i cis faktorji s pomocjo iniciatorskega proteina proteinskega kompleksa pa t i trans faktorji vezava iniciatorjev na ds dna povzroci delno odvitje dupleksa poleg mesta prepoznave in nadaljne delovanje helikaze ki se nahaja v replikacijskih vilicah vodi do novega odvitja dna dupleksa odvitje dna sluzi kot osnova za iniciacijo sinteze dna vendar slika pri zivalskih oz sesalcjih replikonih ni tako jasna ve se da so potrebni iniciatorski proteini ki se vezejo na dna vendar ostaja se vedno odprto vprasanje kam se ti proteini vezejo na specificne ali nespecificne sekvence v genomu rezultati ki jih podajajo so kontradiktorni tocko kjer se dogaja replikacija imenujemo replikacijske vilice replikacija je lahko enosmerna ali dvosmerna kadar poteka replikacija v cirkularnem replikonu nastane struktura ki se imenuje theta medtem ko nastane v mitohondrijskem in kloroplastnem replikonu d zanka pri podvajanju linearnega replikona nastanejo tezave na ' koncu saj podvajanje poteka vedno v smeri ' ' tako pride do vprasanja kam naj se veze polimeraza da bo pripela zadnjo bazo problem so razlicni replikoni resili razlicno sprememba linearnega replikona v cirkularnega tvorba hairpinov na konceh konec ni tocno dolocen primer eukariotski replikon proteini ki se kovalento vezejo na konce dna replikacija je kompleksen proces ki obsega tri stopnje iniciacijo primosomi e coli elongacijo replisomi in terminacijo le malo se ve o proteinih ki sodelujejo najosnovnejsi proteini ki sodelujejo so dnaa pria priprava origina na vezavo dnab s tem da povzroci odvitje dna duplexa dnab deluje kot helikaza veze dnac in je odgovorna se za forward premik dna dnat je odgovorna za preprijetje proteinskih kompleksov dnag deluje kot primaza odgovorna za vezavo rna polimeraze ki sintetizira oligonukleotidni rna zacetnik ssbd proteini ki se vezejo na ssdna preprecijo ponoven nastanek dupleksa variabilnost replikonov glede nacina replikacije dna locimo vec modelov vezava proteinov podvajanje linearnih ds replikonov virusnih fag adenovirus s kovalentno vezavo serina v proteinu ki ga kodira virus s fosfatom na ' koncu virusne dna protein prinese tudi bazo ki komplementarno odgovarja bazi na ' koncu obenem pa sluzi njen ' oh konec kot osnova za elongacijo s pomocjo polimeraze rolling circle kotaleci se krog tako se podvojujeo ss fagi in neki plazmidi iz gram pozitivnih bakterij iniciacijski protein je rep ki prepozna specificne sekvence v ds originu in cepi fosfodiestersko vez v dna ta razcep vkljucuje nukleofilni napad na fosfat s hidroksilno skupino ki lahko izhaja iz aminokisline tirozin ali pa iz vode ob pomoci glutaminske kisline nastanete dva konca ' konec ki sluzi kot primer za dna sintezo in ' konec z vezanim rep proteinom ki se med replikacijo premakne in ko je koncana povzroci nov razcep v verigi in omogoci ligacijo med novonastalim ' koncem in prerazporejenim 'koncem replikacija je lahko nekontrolirana ali kontrolirana zavisi od aminokislin v centru v primeru ko se v centru nahajata dva tirozina poteka po vsakem krogu replikacije nova replikacija protein se ne odcepi iz dna medtem ko pride v primeru ko se v aktivnem centru namesto enega tirozina nahaja glutaminska kislina po drugem razcepu do odcepitve proteina iz dna enosmerni theta le ta nastane pri replikaciji ds cirkularnih plazmidov replikacija poteka le v eni smeri sodeluje lahko samo iniciatorski protein ki ga kodira sam plazmid repe pamb menjava polimeraz omogoca replikacijo le v eno smer ali pa sodeluje tudi iniciatorski potein gostitelja dnaa ki lahko skupaj koordinirata stevilo kopij na celico p plazmid repa se veze na pet bp dolge ponovitve pride do zavoja dna okoli njega in odvitja dna vendar le ob prisotnosti dnaa ki se prvi veze na dve skupini z bp dolgimi ponovitvami v dna homologija z dna boxi v e coli medtem ko deluje rep a kot stimulator orientacija boxov je kriticnega pomena da le ena stran omogoca vezavo dnab dvosmerni theta ki mu sledi rolling circle tako se replicirata herpes virus in l fag ki jima je na ta nacin omogoceno da s pomocjo rolling circla sintetizirata veliko stevilo konkatemer ki se potem pakirajo v virusne partikle pride do prepoznavanja specificnih sekvenc v primeru herpesa je iniciatorski protein ul ki deluje kot dimer in s svojim karboksilnim koncem prepozna specificna zaporedja v dna in ob sodelovanje gostiteljske polimeraze alfa pri lambda fagu pride v zgodnji stopnji replikacije do prepoznanja ori lambda s proteinom o v obliki dimera ki se veze na stiri ponovitve dolge bp znotraj gena za protein o poleg tega se tu veze se protein p ki privede dnab in je obenem njen inhibitor veliko vlogo ima tudi dnaa gostitelja ki kontrolira aktivacijo transkripcije s pr promotorja dvosmerni theta primer je bakterijski replikon e coli iniciacija replikacije poteka iz enega origina oric ob prisotnosti proteinov dnaa dnab dnac hu giraza in ssbd pride do nastanka theta strukture ki nastane ob vezavi do monomerov dnaa proteina na stiri bp dolge ponovitve dna boxi pri tem nastane sredica okoli katere se ovije dna pri tem je potrebno da je dna negativno zavita dnaa deluje na ta nacin na tri ponovitve po bp kjer se nato dna odvije in se nanjo veze en heksamer dnab ki nosi vezan dnac in nastanejo replikacijske vilice struktura dnaa proteina strukturno ne spominja na nobenega do sedaj izoliranega vezavnega proteina ugotovili so da je za vezavo na dna odgovornih amino kislin na karboksilnem koncu in predstavljajo strukturo treh alfa heliksov dvosmerno linearno tako poteka replikacija pri eukarotski celici primer je kvasovka saccaharomyces cerevisiae pri kateri so nasli specificne sekvence imenovane ars autonomously replicating sequence na katere se veze iniciatorski proteinski kompleks proteinov orc ki povzroci ovitje dna okoli njega model predstavlja ars ki se sestoji se iz delov a b in c a podrocje imenovano tudi korna sekvenca obsega bp in je edini del znotraj ars ki je homologen med vsemi in je nujno potreben za iniciacijo replikacije na njenem ' koncu se nahaja t bogato podrocje in nanj se vezejo razlicni transkripcijski faktorji b podrocje ki je potrebno za uspesno in stabilno replikacijo dolzine bp vsebuje podrocja za vezavo transkripcijskega faktorja abf c podrocje dolzine bp ki se nahaja bp od ' konca podrocja a ugotovljeno je da izredno vlogo igra negativno superzvitje dna za iniciacijo replikacije stvarja pa ga tudi giraza ki obenem relaksira pozitivno zavito dna ki nastaja pred replikacijskimi vilicami ugotovljeno je tudi da vse ars sekvence ne sluzijo kot origin replikacije vkljub temu da imajo vse njene znacilnosti replikacija v zivalskih celicah se vedno so kontradiktorni rezultati v zvezi s prisotnostjo oz odsotnostjo specificnih sekvenc za iniciacijo replikacije neke skupine javljajo prisotnost specificnih mesta na kromosomu kjer se zacne iniciacija replikacije npr na ' koncu gena za lamin se nahaja bp ki se samostojno replicirajo v promotorju aldolaznega gena pri podganah je sekvenca bp ki sluzi kot ori medtem pa druge skupine govorijo o razprsenosti iniciacije replikacije ki so jih nasli znotraj netranskribiranega podrocja v genu za rodopsin ter znotraj netranskribirane regije v cloveski rdna vse skupine ki delajo na replikonu iz xenopusa prihajajo do enakih rezultatov in sicer da pride do prehoda iz nespecificne replikacije rdna v zgodnji fazi embriogeneze v ne povsem nakljucno replikacijo ki poteka znotraj netranskribiranih regij dna v casu ko se pricne transkripcija rdna razlagi sta dve ali se je specificnost izgubila zaradi velike prisotnosti materinih iniciatorskih proteinov v zacetni stopnji razvoja embrija ali pa se je replikacija omejila le na doloceno podrocje kromatina zaradi njegove strukturne spremembe ki nastane v casu transkripcije mozen pa je vpliv obeh dejstev replikacija pri sesalcih ima posebno znacilnost ki kaze na prisotnost dveh podrocij ki naj bi bili vkljuceni v iniciacijo replikacije mesta kjer se replikacija pricne in prisotnost oddaljenih sekvenc ki so potrebne da replikacija potece kaj pa so te sekvence je potrebno se dolociti ali so to mesta za vezavo iniciatorskih proteinov ali elementi ki kontrolirajo transkripcijo oz strukturo kromatina regulacija iniciacije replikacije metilacija dna vpliv kinaze odvisne od celicnega cikla prisotnost prereplikativnega kompleksa razlicni cdc proteini mcm proteini fosforilacija beta podenote polimeraze alfa replikacija v odvisnosti od oddaljenost ori sekvenc glede na telomerne sekvence kontrola nepravilne replikacije pri bakteriji bacillus subtilis so ugotovili da se sinteza nepravilno replicirane dna ustavi sele kb od ori in sicer na mestu ki spominja na njegove terminacijske sekvence zapora replikacije zahteva prisotnost alormona ppgpp in replikacijskega terminacijskega proteina v sesalskih celicah so nasli protein p ki inhibira napacno replikacijo na dva nacina z inhibicijo celicne kinaze in pcna faktorja ki je nujen za procesiranje replikacijskih vilic literatura prokaryotic and eukaryotic replicons cell osnova embo journal embo journal gene j biol chem nature pnas pripravljeno januarja nazaj na informacijsko stran dsmb pripombe in vprasanja vezana na vsebino posljite na naslov drobnic ibmi mf uni lj si glede oblikovanja strani pa na naslov marko dolinar ijs si homologna rekombinacija peter dov c uvod homologna rekombinacija je za vse organizme zelo pomemben proces ki omogoca generiranje genetske variabilnosti vzdrzevanje integritete genoma in pravilno razdvajanje kromosomov kljub bioloskemu pomenu homologne rekombinacije pa o biokemijskih detajlih molekularnih mehanizmov ki uravnavajo izmenjavo dna segmentov med homolognimi kromosomi se sorazmerno malo vemo rekombinacija je dokaj kompleksen in z biokemijskega vidika enkraten proces v nasprotju z drugimi procesi v katere so vkljucene nukleinske kisline replikacija transkripcija translacija katerih rezultat je biosinteza makromolekul lahko najenostavnejsi modeli homologne rekombinacije shajajo skoraj brez ali le z minimalno sintezo dna to dejstvo je otezilo razvoj biokemijskih testov ki bi lahko identificirali elemente rekombinacijske masinerije dodatna tezava je v tem da je vmesne stopnje rekombinacijskega procesa tezko izolirati zaradi njihove kompleksnosti labilnosti in sorazmerno nizke pogostnosti v zadnjih letih je kombinacija genetskih molekularnih in biokemijskih metod omogocila razumevanje nekaterih podrobnosti ki tvorijo temelj izmenjavi genetskih informacij med homolognimi odseki dna tako je pri prokariontih in evkariontih v proces homologne rekombinacije vkljucenih vsaj proteinov velika vecina jih ni vkljucena v druge metabolicne procese dna kar dodatno otezuje identifikacijo funkcije posameznih genskih produktov v rekombinacijskem procesu poleg proteina reca ki v procesu homologne rekombinacije omogoca parjenje in izmenjavo homolognih odsekov so za delovanje sistema potrebne se helikaze dnaze atpaze topoizomeraze dna polimeraze dna ligaze ter proteini ki vezejo dna in atp sem lahko pristejemo se cis element specificno dna zaporedje hi ' gctggtgg ' ki je sprva veljalo za rekombinacijski hot spot v bakteriofagu lambda pomembno pa je tudi za rekombinacijo v e coli pojav sinaptonemalnega kompleksa in kiazem v profazi prve mejoticne delitve je ze dolgo znana mikroskopsko vidna pojavna oblika rekombinacijskega procesa ki podpira ugotovitev da proces rekombinacije ni direktno povezan z replikacijo dna modeli homologne rekombinacije genetski modeli prototipni model homologne rekombinacije je predlagal holliday pred vec kot tridesetimi leti model vkljucuje tri bistvene lastnosti izmenjavo niti omogocata enojna preloma v obeh dvojnih vijacnicah simetricna izmenjava dna niti povzroci nastanek heterodupleksov tako nastala zveza holliday junction se lahko razresi na dva mozna nacina posledica cesar je nastanek dveh razlicnih tipov rekombinantnih molekul ta model dokaj dobro pojasnjuje bistvo homologne rekombinacije vkljucno s fenomenom konverzije genov ob odsotnosti replikacije dna kasneje je model dozivel nekaj modifikacij ki sicer ohranjajo osnovno idejo vendar spreminjajo nekaj bistvenih podrobnosti messelson radding aviemore model vkljucuje zacetek rekombinacije z enojno dna nitjo v povezavi z replikacijo napadom dvojne vijacnice in degradacijo odstranjene dna niti ta model obravnava nastanek asimetricnih heterodupleks regij in kopiranje genetske informacije niti napadalke model popravljanja dvojnega preloma double strand break repair predlaga zacetek rekombinacije na mestu dvojnega preloma molekule dna delno degradacijo obeh koncev napad enojne dna niti na homologno dvojno vijacnico in popravek preloma z vkljucitvijo genetske informacije donorske napadene molekule za sam potek homologne rekombinacije je v celici na voljo vec razlicnih poti pathways katera od poti bo uporabljena je odvisno od genetskega ozadja organizma in v veliki meri od tipa molekul ki so vkljucene v rekombinacijski proces plazmidi baktefriofagi inter intra kromosomska rekombinacija tako zahteva npr konjugacijska rekombinacija vse proteine ki so vkljuceni v recf pot rekombinacija v katero je vkljucen linearen dimeren plazmid pa le proteina rece in rect biokemijski modeli kljucnega pomena za razvoj in vitro sistemov za studij homologne rekombinacije je bilo odkritje funkcije reca proteina ki tudi in vitro omogoca tvorbo paranemicnih povezav in za svojo funkcijo potrebuje atp in prost konec ssdna najpomembnejse fasete predstavlja studij mehanizmov napada dna molekul iniciacija homologno parjenje siritev obmocja heterodupleksa razresitev zveze in studij mehanizmov ki uravnavajo prileganje annealing homolognih partnerjev iniciacija renaturacija popravilo in ligacija proteini ki so vkljuceni v homologno rekombinacijo pri e coli reca omogoca izmenjavo dna niti renaturacijo dna je dna odvisna a tpaza dna in atp odvisna koproteaza recbcd eksonukleaza v dna helikaza atp odvisna dsdna in ssdna eksonukleaza atp stimulirana ssdna endonukleaza razpoznava c zaporedje recbc dna helikaza rece eksonukleaza viii dsdna eksonukleaza specificno delovanje v ' ' smeri recf veze ssdna dsdna in atp recg omogoca potovanje mosticka v holliday zvezah dna helikaza recj ssdna eksonukleaza specificno delovanje v ' ' smeri recn funkcija ni znana vsebuje konsenzus sekvenco za vezavo atp reco interakcija z recr in verjetno z recf proteinom recq dna helikaza recr interakcija z reco in verjetno z recf proteinom rect renaturacija dna ruva veze razlicne oblike zvez holliday interakcija z ruvb proteinom ruvb migracija mosticka v holliday zvezah dna helikaza interakcija z ruva proteinom ruvc cepitev holliday zvez sbcb eksonukleaza i ssdna eksonukleaza deluje v ' ' smeri deoksiribofosfodiesteraza sbccd atp odvisna dsdna eksonukleaza ssb veze ssdna dna topoizomeraza i w protein topoizomeraza tipa i dna giraza gyra gyrb dna giraza topoizomeraza tipa ii dna ligaza lig dna ligaza dna polimeraza i pola dna polimeraza ' ' eksonukleaza ' ' eksonukleaza helikaza ii uvrd uvre recl mutu dna helikaza helikaza iv held dna helikaza literatura kowalczykowski et al biochemistry of homologous recombination in e coli microbiol rev cell cell experientia pnas j biol chem pripravljeno februarja nazaj na informacijsko stran dsmb pripombe in vprasanja vezana na vsebino zadnjega povzetka posljite na naslov peter dovc uni lj si glede oblikovanja strani pa na naslov marko dolinar ijs si molekularna biologija prionskih bolezni marko dolinar na voljo je tudi dopolnjena verzija tega povzetka z relevantnimi www povezavami pripravljena za mikrobioloske vecere ki jo bom poskusal dokler bo slo drzati v korak s casom z novimi dodatki prenosljive encefalopatije so nevrodegenerativna obolenja pri zivalih in ljudeh povzrocitelj je prion strukturno spremenjena molekula normalnega celicnega proteina prpc in predstavlja najmanjsi znan patogen spekter bolezni ki jih povzroca zajema pri cloveku kuru bolezen novogvinejskih kanibalov ter dedne creutzfeldt jakobovo bolezen cjd gerstmann sträußler scheinekerjev sindrom gss in usodno dedno nespecnost ffi pri zivalih pa med drugim skrapiozo ovce in koze in spongiformno encefalopatijo pri govedih bse znano pod imenom 'bolezen norih krav' odkrili so jo pri govedih holsteinsko frizijske pasme in ugotovili da prioni iz goveda lahko okuzijo prasice koze ovce in misi ne pa tudi hrckov zdravila za te bolezni ni normalni celicni prpc na doslej se ne povsem raziskan nacin posttranslacijsko preide v patogeno obliko prpsc ta prehod spremlja sprememba v strukturi prp ir spektroskopija in analize s cirkularnim dikroizmom so pokazale da prpc vsebuje alfa helikalne strukture in skoraj nic beta strukture medtem ko vsebuje prpsc oblika beta in helikalne strukture kristalizacija nobene od oblik prp se ni dala rezultatov zato so modeli terciarne strukture zgolj hipoteticni s predikcijskimi algoritmi so ugotovili mozne strukturne sklope in trije od stirih sinteticnih peptidov narejenih na osnovi teh studij so se v raztopini zvili v beta obliko ter se agregirali v palicke z amiloidnimi lastnostmi struktura prp pomemben prispevek k razumevanju narave bolezni je bila izolacija prionskega proteina najprej iz okuzenih hrckovih mozgan zatem pa tudi odkritje cdna ki zapisuje za ta protein protein je kodiran na kromosomalni dna in nivo mrna za ta protein je enak pri zdravih in obolelih osebkih normalni prionski protein prpc je glikoprotein velikosti kda in je obcutljiv na delovanje proteinaz medtem ko so iz obolelih mozgan izolirali obliko ki je rezistentna na proteinaze in ima maso kda pri hrcku in misih je primarni translacijski produkt protein z aa in zapis zanj je enak pri bolnih in zdravih zivalih cloveski prp sestavlja aa in vkljucuje aa dolgo signalno sekvenco ki se odcepi ob prehodu v er preko ga protein preide na celicno povrsino kamor se zasidra z glikoinozitolnim fosfolipidom gpi s c ternimalnega dela molekule pa se odcepi se aa na podrocju zanke ki nastane za disulfidno vezjo sta vezana oligosaharida pripeta na asp v ga se na oba oligosaharida veze se sialinska kislina kot je znacilno za vse proteine sidrane preko gpi tudi prpc ponovno vstopi v celico preko membranskih veziklov ob strukturni spremembi prpc v prpsc so opazili da se z omejeno proteolizo z n terminalnega dela prpsc odcepi se okrog aa preostanek pa je za proteaze rezistenten in ga ozncujejo kot prp model replikacije prionov konformacijski model replikacije prionov je takle prpc bi se stohasticno pretvoril v delno razvit monomer prp ki je intermediat v tvorbi prpsc prp lahko preide nazaj v prpc lahko se razgradi lahko pa tvori prpsc pod normalnimi pogoji bi bilo prp malo in prpsc bi nastajal v nesignifikantnih mnozinah pri infektivnih prionskih boleznih bi eksogeni prioni ki vsebujejo prpsc delovali kot matrice za pretvorbo prp v prpsc ker je prpsc netopen bi bila reakcija ireverzibilna ker bi se koncentracija prp zaradi pretvorbe v prpsc zmanjsala bi to povzrocilo povecanje nastajanja iz prpc in na ta nacin bi ponovno lahko prislo do tvorbe prpsc pri podedovanih prionskih boleznih bi mutacija v prpc destabilizirala strukturo proteina in povecala nastajanje prp s tem pa bi se povecala verjetnost nastajanja prpsc narava mutacij ki so jih doslej identificirali pri dednih prionskih boleznih to hipotezo podpira saj so mutacije na obmocju kjer so napovedali helikalno strukturo ali pa na delu molekule ki naj bi vzdrzevala stabilnost celokupne strukture sporadicne prionske bolezni hipoteza razlaga s slucajnim nakopicenjem prp pri transgenih misih ki prekomerno eksprimirajo normalni gen za prp pride do nastanka prionov in razvoja spongiformne degeneracije prav tako je mogoce da pride pri spontanih oblikah bolezni do mutacij ki imajo enak ucinek kot mutacije pri dednih oblikah bolezni medvrstna bariera ze dolgo je znano da lahko prioni izolirani iz obolelih organizmov povzrocijo razvoj bolezni pri pripadnikih druge vrste s poskusi na transgenih misih so ugotovili da je infekcija najbolj ucinkovita ce sta n terminalni aminokislinski zaporedji prpsc iz ene vrste in prpc druge vrste identicni v nasprotenem primeru se bolezen sicer razvije a z daljso inkubacijsko dobo pri tem govorijo o medvrstni barieri vendar je zanimivo da so naslednje pasaze infektivnega agensa vedno bolj efektne in se inkubacijska doba krajsa kar kaze na to da se morda aminokislinska zaporedja prpc in prpsc izenacijo pri knockout misih brez prp prn p so opazili da se po inokulaciji s prioni misje skrapioze bolezen ne pojavi niti po letih medtem ko so testne w t misi poginile v mesecih genska struktura in ekspresija genetsko gledano so prionske bolezni dveh tipov ene so dedne druge pa spontane frekvenca sporadicne cjd je vendar so patolosko dedne in spontane oblike bolezni enake tistim ki jih povzrocino z inokulacijo prpsc v zdrav organizem pri dednih oblikah bolezni so ugotovili jasno segregacijo bolezenskih znakov z mutacijami v genu prn p to pomeni da so mutacije zadosten razlog za konformacijski prehod prpc v prpsc in s tem razvoj bolezni mutacije pa same ne povzrocijo bolezni pac pa povecajo pogostost konformacijske konverzije v prpsc obliko pri cloveku je gen za prp lociran na kratkem kraku kromosoma orf za prpc je v celoti znotraj enega eksona kar pomeni da variante prp ne morejo nastati zaradi alternativnega splicinga rna celotni gen je pri hrckih na eksonih ki sta locena z kb intronom pri misi pa na eksonih mrna za prp se pri odraslih zivalih eksprimira konstitutivno najvecja koncentracija mrna je v mozganskih nevronih dedne prionske bolezni pri cloveku okrog primerov cjd je dednih mutacija na kodonu prp je genetsko povezana z gss ko so uvedli mutacijo na ustreznem mestu pri transgenih misih so opazili spontane degenerativne znake v cns tipicne za misjo skrapiozo vendar pa je bila mnozina prpsc v mozganih teh misi zelo nizka pri juznoangleskih druzinah z dedno cjd so opazili insercijo bp ki kodira za ponovitev oktapeptidne sekvence normalni prp vsebuje le takih ponovitev nekateri drugi osebki s cjd so imeli po ali dodatnih ponovitev delecija enega ali insercija takih ponovitev pa ne povzroci bolezni cjd je pogosta med izraelskimi zidi ki izhajajo iz libije sprva so menili da je razlog v tem da jedo na hitro prekuhane ovcje mozgane in oci vendar pa so pri nekaterih libijskih in tunizijskih zidih s cjd odkrili tudi mutacijo na kodonu gre za avtosomalno dominantno okvaro kakrsna je npr huntingtonova bolezen identificirali so se vrsto drugih mutacij ki koincidirajo z razvojem prionskih bolezni po eni od teorij povzroci mutacija v prp vecjo obcutljivost posameznika za napad virusa skrapioze prehod prpc v prpsc in vitro za proteaze rezistentno obliko prp je uspelo pripraviti in vitro v brezcelicnem sistemu kar utegne razjasniti mehanizem konformacijskega prehoda in spekter medvrstnih barier do tvorbe rezistentne oblike pride ko radioaktivno oznacenemu prpc dodajo neoznacen prpsc ki deluje kot jedro konformacijske spremembe v dveh dneh in vivo bi bilo pri transgenih misih potrebno vsaj dni da bi zaznali degenerativno spremembo v cns do konformacijskega prehoda verjetno pride po tem ko v prvi fazi prpsc z delno nativno strukturo interagira s prpc stabilizacija beta strukture prpc tvorba h vezi med molekulama med pretvorbo ni potrebna sinteza nove prpc niti sprememba v glikozilaciji niti ni potrebna prisotnost glikofosfatidil inozitolne stranske verige gre torej za direktno interakcijo med dvema oblikama proteinskih molekul kvasni prioni protein z lastnostmi priona so odkrili tudi pri kvasovkah protein ure p ki je udelezen v metabolizmu dusikovih substanc pri kvasovkah in je bil sam znan ze pred vec kot leti lahko v redkih primerih spontano s frekvenco preide v neaktivno obliko ure p ki nato povzroci inaktivacijo vseh preostalih funkcionalnih molekul ure p tak fenotip oznacujejo kot ure in 'mutacijo' ki ga je povzrocila ure p je kodiran na kromosomskem genu inaktivacijske ali delecijske mutacije povzrocijo enak fenotip kot selekcija mutant je lahka saj mutante lahko porabljajo ureidosukcinat v prisotnosti nh in s tem lahko kljub temu da ne morejo sintetizirati prekurzorja uracila rastejo v odsotnosti uracila podobno je z determinanto ki so jo opisali kot modifikatorja nonsense supresije pod vplivom trna odgovoren je produkt gena sup dolg aa in na n terminalnem delu vsebuje ponovitve aa kar je podobno kot pri prp pri ure p takih ponovitev sicer ni vendar je mehanizem delovanja podoben literatura prusiner s b molecular biology of prion diseases science carlson g a et al genetics of prion infections trends in genet bayreuther k masters c l catching the culprit prion nature cohen f e et al structural clues to prion replication science weissmann c the prion connection now in yeast ibid tuite m f psi no more for yeast prions nature wickner r b is an altered ure protein evidence for a prion analog in saccharomyces cerevisiae science kocisko d a et al cell free formation of protease resistant prion protein nature bessen r a et al non genetic propagation of strain specific properties of scrapie prion protein nature kocisko d a et al species specificity in the cell freee conversion of prion protein to protease resistant forms a model for the scrapie species barrier proc natl acad sci usa povzetek je bil pripravljen za www marca pripombe in vprasanja vezana na vsebino zadnjega povzetka pa tudi glede oblikovanja strani posljite na naslov marko dolinar ijs si nazaj na informacijsko stran dsmb principi regulacije cdk kinaz cdk's angl cyclin dependent protein kinases lana strmecki od ciklinov odvisne kinaze cdk igrajo glavno vlogo v regulaciji poteka celicnega cikla delovanje samih cdk pa regulirajo stevilni izvencelicni in znotrajcelicni signali in sicer preko enega od stirih razlicnih visoko ohranjenih biokemijskih mehanizmov prehode med stanji celicnega cikla v eukariotskih celicah sprozijo cdk kinaze prehodi se morajo zgoditi ob pravem casu in v pravem zaporedju zato so cdk kinaze tesno regulirane preko nekaj kompleksnih mehanizmov v enostavnih sistemih kot je naprimer zabji zarodek v zgodnjem stanju je aktivnost cdk kinaz odvisna od biokemijskega oscilatorja ki je neodvisen od dogodkov ki jih sprozi v somatskih ter kvasnih celicah je prislo do razvoja dodatnih regulatornih mehanizmov ki zagotavljajo da se aktivnost cdk kinaz med ciklom spreminja in tako vpliva na zakasnitev posameznih faz v primeru ko pogoji niso optimalni ali pa v primeru ko prejsna faza ni potekla do konca oscilatorji so v celicah regulirani s strani stevilnih znotrajcelicnih in izvencelicnih signalov nivo cdk kinaz znotraj celic se med celicnim ciklom ne spreminja regulacija aktivnosti je na post translacijsem nivoju aktivne cdk kinaze vsebujejo vezan ciklin in so fosforilirane na visoko ohranjenem treoninu kinaze ki fosforilirajo cdk se imenujejo cak kinaze angl cdk activating kinases aktivni kompleks cdk ciklin inhibirajo kinaze ki kompleks fosforilirajo na ohranjenem treonin tirozinskem paru ter cki's angl cdk inhibitory subunits ki vezejo cdk kinaze biokemijske mehanizme aktivacije in inhibicije cdk kinaz poznamo slabo sele identifikacija proteinov in encimov ki sodelujejo bo razjasnila te kompleksne mehanizme aktivacija podvajanja dna pri kvasovki regulacija prehoda g s do sedaj je bilo ugotovljenih ze veliko stevilo beljakovin ki sodelujejo pri aktivaciji podvojevanja dna pri kvasovki se vedno pa je molekularna osnova regulacije faze s slabo poznana ker vecjega dela kontrolnih poti ne poznamo v osnovi gre pri podvojevanju za osnovne korake nastanek kompleksov na specificnih zaporedjih dna imenovanih origini prisotnost encimov in beljakovin ki sodelujejo pri iniciaciji sinteze dna in pri sami sintezi dna ter nastanek signala ki omogoci da celice preidejo v delitev torej preko tocke imenovane start imamo le zelo nejasne obrise poti ki vodi do aktivacije faze s in se ta je dobljena z interpretacijo rezultatov posameznih delckov poti zacne se z vezavo orc na element ars nadaljuje se z vezavo transkripcijskih faktorjev na kompleks ars orc ki regulirajo ekspresijo genov potrebnih za podvojevanje dna proteini druzine mcm verjetno delujejo kot nekaksni licencni faktorji ki omogocajo aktivacijsko vlogo orc ars kompleksa na aktivacijo origina vplivajo se stevilni drugi proteini kot so cdc dbf in cdks ki delujejo kasno v g med procesom aktivacije origina pride do vezave polimeraze alfa primaze na kompleks na originu pri tej vezavi verjetno sodeluje mcm protein pri podvojevanju pride do deaktivacije licencnih faktorjev mcm mcm in cdc in tako origini postanejo neuporabni do naslednjega cikla prehod v mitozo regulacija prehoda g m prehod celic v mitozo je povezan z aktivacijo mpf maturation promoting factor mpf je sestavljen iz ser thr specificne protein kinaze p cdc in ciklina b med g fazo celicnega cikla se p cdc fosforilira in prav kolicina foforiliranih thr cdc kinaze igra pomembno vlogo pri regulaciji mitoze aktivnost cdc regulirata wee cdc specificna kinaza in fosfataza cdc oba proteina sta regulirana s strani celicnega cikla cilj raziskav v prihodnosti je razjasnitev wee cdc regulatornega sistema in ugotavljanje povezav z ostalimi mitoznimi regulatornimi sistemi pri eukariotih stevilne cdk kinaze vplivajo na iniciacijo in potek vsake od zaporednih faz celicnega cikla pricetek mitoze je tesno povezan z aktivacijo mpf mpf je heterodimerna cdk kinaza sestavljena iz protein kinaze cdc in ciklina b na meji med metafazo ter anafazo mitoze pride do razgradnje ciklinske podenote kaj vec pa o sami posttranslacijski regulaciji ciklinske podenote ni znano vec vemo o regulaciji cdc katalitske podenote cak fosforilira cdc na thr in jo tako aktivira wee prav tako fosforilira cdc in sicer na thr in jo tako inhibira eden zadnjih dogodkov ki omogocijo prehod celic v mitozo je defosforilacija cdc na thr in ki ga katalizira cdc fosfataza pri s pombe prav tekmovanje med kinazo wee ter fosfatazo cdc vpliva na cas vztopa v mitozo oba gena tesno regulirajo stevilne up stream lezece kinaze in fosfataze do sedaj ni razjasnjeno kako regulacija cdc vpliva na prehod celic v mitozo zanimivo je da med stevilnimi raziskovanimi organizmi regulacija preko thr ni tako zelo ohranjena kot bi pricakovali postavlja se vprasanje v koliksni meri so mehanizmi regulacije aktivacije faze m ohranjeni med vrstami prehod v fazo m je verjetno reguliran s strani procesov zgodnejsih faz celicnega cikla kot je naprimer proces podvojevanja dna poleg wee cdc sistema obstajajo se drugi sistemi ki regulirajo prehod v mitozo fosforilacija cdc na thr je pomemben korak pri aktivaciji kinazne aktivnosti cdc fosforilacijo thr opravlja cak kinaza ki je prav tako regulirana preko fosforilacije pomembna tocka regulacije bi lahko bila fosforilacija in defosforilacija cak v odvisnosti od celicnega cikla vendar je ugotovljeno da je fosforilacija thr med celicnim ciklom konstitutivna med g fazo stevilni majhni proteini imenovani cki's vezejo cdk kinaze in jih tako inhibirajo do sedaj se niso nasli sorodnih proteinov ki bi inhibirali cdc med g fazo pri s pombe cdc veze suc in sorodni majhni proteini ki pa kinaze ne inhibirajo in njihova vloga ni razjasnjena ugotovljeno je da se cdc ciklinb kompleksi zamrznjenih torej ne delecih celic ter celic ki se normalno delijo razlikujejo po velikosti kompleks pri zamrznjenih celicah je manjsi morda oligomerizacija cdc polipeptida vpliva na indukcijo mitoznih procesov razlicne podenote omogocajo prepoznavanje razlicnih substratov vplivajo na intracelularno lokalizacijo ali pa vplivajo na kaksne druge lastnosti proteina poleg tega ne smemo pozabiti da morda obstajajo se kaksni vzporedni mehanizmi kontrole prehoda v mitozo ki tekmujejo s cdc proteinom literatura nature page march cell page june cell page october tibs page april science page november tibs page feb trends in cell biol page june nature page march cell page sept povzetek je bil pripravljen za www aprila pripombe in vprasanja glede vsebine zadnjega povzetka posljite lani strmecki ibmi mf uni lj si glede oblikovanja strani pa na naslov marko dolinar ijs si nazaj na informacijsko stran dsmb molekularna osnova septicnega soka roman jerala lipopolisaharidi lps so glavna sestavina zunanje membrane gram negativnih bakterij sestavljeni so iz lipidnega dela imenovanega lipid a sladkornega preostanka kdo in o specificnega antigena ki se razlikuje med vrstami bakterij in predstavlja najpomembnejso antigensko komponento prav lipopolisaharidi oz lipid a so povzrocitelji septicnega soka lps predstavlja za celice organizma mocan signal ki sprozi izlocanje citokinov tnfa il beta il il in drugih npr adhezijskih molekul ti mediatorji nato povzrocijo simptome septicnega soka ki lahko vodijo v odpoved organov ards adult respiratory distress syndrome in pogosto v smrt samo v zda umre letno zaradi septicnega soka pr ljudi lps se ob vecjih koncentracijah lahko direktno vgradi v membrano lahko pa se veze na razlicne receptorje pri x manjsih koncentracijah ki ze lahko povzrocijo simptome septicnega soka pa je odziv celic odvisen od receptorja cd ta receptor se nahaja v membrani makrofagov in nevtrofilcev vsidran preko fosfatidilinozitolnega preostanka v serumu obstaja tudi topna oblika cd ki je odgovorna za delovanje na celice ki nimajo membranskega lps epiteijske endodelijske celice za popoln odziv je potrebna se prisotnost proteina lbp lipopolysaccharide binding protein v serumu lbp deluje kot katalizator ki se veze na micele lps in prenese monomer lpsa na cd po vezavi lps na cd naslednja stopnja se ni pojasnjena veliko truda je trenutno usmerjenega v iskanje domnevnega membranskega receptorja za lps in cd ki bi prenesel signal na citoplazemsko stran membrane v citoplazmi se najbrz aktivira od ceramida odvisna protein kinaza ki sprozi kaskado fosforilacij ki vodijo do aktivacije nfkb preko inaktivacije njegovega inhibitorja nfkb se nato v jedru veze na specificne regulacijske sekvence in sprozi transkripcijo stevilnih molekul ki sodelujejo v akutnem odzivu predvsem tnfa in il b trenutno ne obstaja ucinkovita terapija septicnega soka v fazi preizkusanj so razlicna protitelesa proti lps tnfaomega druga potencialna zdravila so analogi lps ki delujejo kot antagonisti peptidi ki lahko vezejo in nevtralizirajo lps npr antibiotik polymixin b rekombinantni cd lipoprotein ref ulevitch and tobias current opinion in immunology povzetek je bil pripravljen za www junija pripombe in vprasanja glede vsebine zadnjega povzetka posljite romanu roman jerala ijs si glede oblikovanja strani pa na naslov marko dolinar ijs si nazaj na informacijsko stran dsmb genska terapija up to date lana strmecki pristopi v idealnem primeru bi genska terapija bila nekaksna transplantacija kjer bi mutiran gen nadomestili z normalnim jasno da so tehnicne tezave ogromne gen je potrebno v celice vkljuciti tako da je zagotovljena dovolj stabilna ekspresija gena nastali proteinski produkt naj bi kompenziral pomankanje zaradi okvare originalnega gena ta pristop je najbolj primeren za zdravljenje recesivnih monogenskih bolezni in ni primeren za dominantno dedovane okvare kjer spremenjeni protein spremeni delovanje celice ta pristop je torej neprimeren za vse tiste bolezni kjer je potrebno odstraniti vpliv spremenjenega proteina npr rakasta obolenja infekcijske bolezni tezave pri izbiri pogojev za gensko terapijo pogoje za uspesno gensko terapijo je zelo tezko izpolniti na vseh nivojih najprej je potebno izolirati zeljeni gen skupaj z vsemi njegovimi regulatornimi sekvencami uporaba uspesnega mehanizma za vkljucevanje gena v tarcne celice zagotoviti je potrebno dovolj veliko stevilo celic za transdukcijo uspesno vstavljen gen naj bi proizvajal dovolj veliko kolicino proteina cim dalj casa zagotoviti primeren in uspesen prenos transduciranih celic v bolnika ekspresija in vivo ne korelira vedno z ekspresijo in vitro nastajajoci protein ne sme imeti slabih stranskih ucinkov regulacija ekspresije gena poterebno je vedeti ali gre za hisni ali za tkivno specificni gen vemo da je regulacija teh dveh skupin genov zelo razlicna poleg tega so nekateri tkivno specificni geni regulirani se razvojno in za svojo ekspresijo potrebujejo zelo natancno regulacijo svoje ekspresije to je pozitivno in negativno regulacijo kompleksnejsa regulacija je prisotna tudi pri vseh proteinih ki so le ena od podenot polipeptida ali holoencima poznamo dva razreda regulatornih zaporedij cis delujoci elementi se nahajajo na istem kromosomu nekateri delujejo kot promoterji lezijo ' glede na gen in vsebujejo zaporedja ki sodelujejo pri vezavi rna polimeraze drugi delujejo kot enhancerji zaporedja ki povecajo uspesno delovanje promoterjev delujejo v obeh smereh se nahajajo ' ali ' glede na gen in so navadno precej oddaljeni trans delujoci elementi so trans delujoci regulatorni proteini ki nastajajo na drugih kromosomih in delujejo na obe kopije alelov gena verjetno bo za uspesno regulacijo prenesenega gena potrebno zagotoviti vse cis delujoce elemente medtem ko bo trans delujoce regulatorne proteine zagotovila celica sama obseg dna potrebne za normalno ekspresijo posameznih genov analizirajo na transgenih zivalicah kjer je tuja dna vstavljena v genom in je prisotna v razlicnih tkivih ugotovljeno je da je za ekspresijo razvojno reguliranih cloveskih genov za globin ter globin potrebnih kb ' glede na genski lokus tako velikih kolicin dna za sedaj ne moremo uspesno vgraditi v nobenega od znanih vektorjev prenos in spreminjanje gena sam prenos tuje dna v celice ni tako problematicen problem je predvsem v tem kaj se potem zgodi z vstavljeno dna dna lahko povsem uspesno prenesemo z fizikalnimi metodami kot so elektroporacija prenos s pomocjo ca fosfata ali pa prenos s pomocjo kationskih lipidov problem nastane pri uspesni integraciji prenesene dna v genom celice saj se ne vgrajena dna razgradi v zelo kratekem casu retrovirusov se uspesno vgradijo v genom celice uporablja se genetsko spremenjene retroviruse ki ne vsebujejo genov potrebnih za razmnozevanje virusa uporabo teh virusov omejujeta velikost dna ki jo lahko tak retrovirusni vektor nosi in pa lastnost retrovirusov da lahko inficirajo le delece celice poleg tega je vgraditev v genom nakljucna in zato obstaja nevarnost negativnih stranskih ucinkov kot je na primer insercijska mutageneza adenovirusni vektorji lahko nosijo nekaj vec dna in infecirajo tudi celice ki se ne delijo slaba stran adenovirusov je da nosijo cel kup svojih genov ki sprozijo imunski odziv in druge stranske ucinke zelo zanimivi vektor je spremenjeni parvovirus imenovan aav integrira se specificno v podrocju daljse rocice kromosoma zelo veliko se raziskuje v smeri specificnega ciljanja dolocenih celicnih populacij za to potrebujemo specificen protein ki se veze na dolocene celicne receptorje na proteinu pa je vezan vektor naprimer na azialoglikoprotein vezan polilizin veze specificne receptorje na hepatocitih ki internilarizirajo glikoproteine ki se koncujejo z galaktozo drug primer je dna vezana na transferin ki se veze na celice ki nosijo transferinske receptorje zelo uporabno bi bilo razviti sistem kjer bi prislo do vnosa direktno v jedro in ne v lizosome tak sistem bi lahko izkoriscal tkivno specificne retrovirusnega vektorje ali pa tkivno specificnie promoterje ki bi jih vseboval vneseni retrovirus vnos dna v obliki ekstrakromosomalnih elementov bi bil zanimiv pristop taksen element nastane pri fuziji misjih celic in kvasnim umetnim kromosomom yac ki nosi cloveski gen na zalost ti elementi slabo segregirajo in se zgubljajo med delitvijo celice za boljse razumevanje dela z ekstrakromosomskimi elementi bo potrebno ugotoviti kateri segmenti centromernih in telomernih sekvenc pomagajo pri pravilni segregaciji in obnavljanju kromosomov gensko terapijo bi lahko izvajali tudi z reaktivacijo sorodnih neaktivnih genov kot je to primer pri globinskih genih napako v globinskem genu bi lahko popravili z reaktivacijo globinskega gena tarcne celice pri prvih poizkusih prenosa genov so uporabljali limfocite dolocene vrsto t limfocitov so izolirali iz tumorjev in razrascali in vitro pri tem so jih genetsko spremenili in kasneje ponovno injicirali v telo ti limfociti so se vgradili v tumorje in povzrocili odmiranje tumorskih celic bolj uporabne bi bile hematopoetske materinske celice vecina teh celic ni v fazi delitve in so zato neinfektivne za retrovirusne vektorje spodbujanje deljenja teh celic z uporabo hematopoetskih rastnih faktorjev je dalo le omejene rezultate nedavno so odkrili posebno vrsto hematopoetskih celic ki krozijo po krvi in jih razpoznamo po specificnih cd antigenih ki jih nosijo na povrsini te celice se naselijo v kosteh kjer smo pred tem unicili kostni mozeg in se tam razrascajo v tej fazi jih lahko s pomocjo hematopoetskih rastnih faktorjev transduciramo z retrovirusnimi vektorji zelo veliko genetskih obolenj je povezanih z jetri jetra sestavljajo nedeleci diferencirani hepatociti ki so neobcutljivi na infekcijo z retrovirusi hepatocite lahko inficiramo z retrovirusi in vitro in sicer med fazo diferenciacije v zrelo obliko hepatocita tako spremenjene hepatocite so injicirali v portalno veno in celice so se naselile v jetrih in tam izrazale preneseni gen pri tem je zal potrebno odstaniti del jetrnega tkiva za gensko terapijo so uporabili tudi keratinocite ne pa tudi keratinocitskih materinskih celice prenos genov je mozen tudi v fibroblaste in endotelijske celice zil te celice imajo veliko moznosti za uspesno uporabo ker so razsirjene po celem telesu epitelijske celice zracnih poti so zlasti zanimive za gensko terapijo cisticne fibroze pri zdravljenju te bolezni so uporabili adenoviruse in dosegli mesecno uspesno ekspresijo cftr gena klinicne aplikacije monogenske bolezni poznamo vec kot monogenskih bolezni dosedanja prizadevanja so usmerjena v terapijo monogenskih recesivnih bolezni ker patologije dominantnih obolenj se ne razumemo povsem z vnosom zdravega gena so dosedaj pri ljudeh poizkusali zdraviti cisticno fibrozo hiperholesterolemijo pomankanje antitripsina fenilketonurijo scid itd rakasta obolenja pri zdravljenju rakastih obolenj se uvaja kar nekaj razlicnih strategij preko povecevanja imunskega odgovora proti tumorjem uvajanje genov v tumorje ki povzrocajo celicno smrt ter prenos vnos tumor supresor genov imunski odgovor lahko stimuliramo preko spreminjanja lastnosti mhc i specificnih citotoksicnih limfocitov t cd cd celice potebujejo za aktivacijo peptid vezan na mhc i ter citokine il if in tnf ki jih izlocajo celice pomagalke torej bi lahko v cd celice vnesli gene za citokine in tako zagotovili lastno aktivacijo cd celic celicno smrt lahko povzrocimo z vnosom timidin kinaznega gena herpes simplex virusa hsv tk celice okuzene z hsv tk lahko ubijemo z dodatkom zdravil kot je ganciklovir ki v fosforilirani obliki vpliva na nepravilno podvojevanje dna na ta nacin bi lahko zdravili tumorje mozgan virus injiciran v blizino tumorja bi se vgradil le v tumorske celice saj so te edine ki se delijo z razliko od ostalih okoliskih mozganskih celic z dodatkom ganciklovira povzrocimo specificno celicno smrt celic ki so sprejele hsv infekcijske bolezni zelo veliko raziskav je usmerjenih v zdravljenje aids a aids je pridobljena genetska bolezen kjer se virusna rna preko reverzne transkripcije vgradi v genom okuzenih celic virus bi radikalno odstranili preko unicenja celotne populacije celic ki jih virus okuzi v tem primeru limfocitov t drug nacin pa bi bil z selektivnim ugonabljanjem celic ki nosijo hiv genom preko na primer site specificne rekombinacije v tem trenutku nobeden od opisanih pristopov ni dovolj raziskan ostale aplikacije genske terapije razvija se sisteme za vnos hormonov faktorjev koagulacije antikoagulantov ter drugih terapevtskih faktorjev mioblasti so zelo primerni ker spontano postanejo del misicno vaskularnega tkiva produkti vnesenih genov se izlocajo v kri kjer krozijo in opravljajo svojo vlogo pri zdravljenju zivcnih obolenj parkinsonova bolezen alzheimerjevo obolenje se raziskuje pristop in vitro razrascanja transduciranih celic ki jih kasneje z reimplantacijo vnesejo na specificna mesta prihodnost genske terapije in eticni problemi o regulaciji ekspresije genov pri sesalcih vemo zelo malo prav tako ne vemo dosti o sekvencah dna ki bi zagotovile stabilnost vgrajenega segmenta dna ker o slabih posledicah vgrajevanja tuje dna v genom ne vemo zelo veliko bi bilo morda bolj smotrno razvijati ekstrakromosomalne oblike prenosa genov zelo velike zaplete pri genski terapiji predstavlja imunski odgovor na terapijo pri vecini monogenskih bolezni ne moremo napovedati fenotipsko izrazanje bolezni kljub prisotnosti identicnih mutacij med osebki in je zato smotrnost genske terapije pri vsakem posamezniku tezko zagovarjati spreminjanje zaporedja dna je za mnoge ljudi apriori odbijajoce v zadnjem casu se vzpostavlja eticna koda in vsaj za zdaj velja da somatska genska terapija nima zelo velikega eticnega vprasanja gre dejansko za neke vrste transplantacijo kjer implantirani gen spremeni genom posameznega organa in ne celotnega telesa sprememba pa se ne prenasa na potomce spreminjanje spolnih celic je v vecini drzav sedaj prepovedana z zakonom literatura british medical bulletin vol gene therapy seminars in oncology feb hospital practice pp nov povzetek je bil pripravljen za www novembra pripombe in vprasanja glede vsebine zadnjega povzetka posljite lani strmecki ibmi mf uni lj si glede oblikovanja strani pa na naslov marko dolinar ijs si nazaj na informacijsko stran dsmb izrazanje genov v fetalnem obdobju gregor majdi c sexual differentiation and normal development of the testis and male genital tract are tightly regulated processes dependent upon a cascade of molecular and morphological events in the past fifty years the incidence of reproductive problems in males including hypospadias cryptorchidism and testicular cancer is reported to have increased progressively in many developed countries several studies have also presented controversial findings suggesting that the average sperm counts and or semen quality have also declined over the same time period it has been suggested that all these problems could arise from events occurring during fetal and or neonatal life male offspring born to mothers who were given diethylstilbestrol des a potent synthetic oestrogen as a preventive to miscarriage were found to have increased incidence of undescended testes urogenital abnormalities and semen abnormalities compared with those from mothers not given des similarities between these observations and the abnormalities being observed in the general population has led to hypothesis that one potential cause of the rise in male reproductive problems might be inappropriate exposure to oestrogens during fetal and or neonatal life the aims of the present studies were to firstly examine the ontogeny of gene expression during normal development of the fetal rat testis and secondly to investigate if oestrogenic chemicals could affect this process as a first step towards elucidating the mechanisms which might account for the observed problems in male reproductive development in the first part of these studies temporal and spatial localisation of several different proteins has been examined using immunocytochemistry novel results regarding localisation of androgen receptor and inhibin subunits are reported which demonstrate differences in their patterns of expression in fetal and adult leydig cells specifically in contrast to their adult counterparts fetal cells do not express androgen receptor suggesting that the negative feedback loop of testosterone on its own production established in adult testis via the androgen receptor is not functional in the fetus inhibin a and bb subunits were localised to leydig cells from days and of gestation respectively in addition functional differentiation of fetal leydig cells has been studied by examining the expression of two steroidogenic enzymes a hydroxylase lyase p c and b hydroxysteroid dehydrogenase b hsd and two orphan nuclear receptors steroidogenic factor sf and dax as expected b hsd and p c immunolocalised exclusively to fetal leydig cells data on immunoexpression of dax has not been reported previously dax protein was first detectable in the fetal rat testis on day in the interstitial cells simultaneously with the onset of testosterone production co localisation of sf and dax in the fetal testis demonstrated that both proteins are not exclusively co localised in the same cell types a finding at odds with suggestions that sf regulates expression of dax in the second part the experiments designed to elucidate potential mechanisms underlying the influence of oestrogens on the developing fetal testis are described studies have focused on the expression of the enzyme p c and the transcription factor sf a significant decrease in mrna expression and enzyme activity of p c occurred in fetuses of mothers treated with des or the environmental oestrogen octylphenol op but this was not mirrored by an obvious reduction in b hsd immunostaining the reduction in p c expression was paralleled by a reduction in sf mrna and protein expression as sf is known to act to regulate multiple genes in the pituitary testicular axis including p enzymes a reduction in expression of this factor could have a significant effect on the development of the testis and genital tract in conclusion these studies have elucidated the cellular site of expression of several gene products implicated in fetal testicular development and demonstrated that in some cases gene expression is reduced in fetuses from oestrogen treated mothers povzetek je bil pripravljen za www decembra pripombe in vprasanja glede vsebine zadnjega povzetka posljite gregorju majdicgr vf uni lj si glede oblikovanja strani pa na naslov marko dolinar ijs si nazaj na informacijsko stran dsmb